O que é NGS (Next-Generation Sequencing)?

ngs-post_blog

A finalização do Projeto Genoma Humano juntamente com o advento e o constante avanço das tecnologias de sequenciamento de nova geração (em inglês, Next-Generation Sequencing –  NGS) proporcionaram o surgimento do que chamamos de “Era Pós Genômica”, onde em um curto tempo e por um preço acessível é possível ter todo ou algumas partes do seu DNA sequenciado e, fácil acesso a diversos bancos de dados que disponibilizam centenas de mutações genéticas.

Contudo, é importante ter em mente que existem diferenças entre as técnicas de NGS, e que não são indicadas para diagnosticar todos os tipos de alterações genéticas.

Minha família tem histórico de Câncer de Mama, posso fazer um Exoma? Minha avó descobriu uma mutação patogênica, como posso me testar?

Antes de explicar o que é NGS, vamos fazer uma breve introdução sobre o sequenciamento de DNA considerado de primeira geração.

O sequenciamento de DNA

Os sequenciadores de DNA são equipamentos que leem uma amostra de DNA e geram um arquivo eletrônico com símbolos que representam a sequência de bases nitrogenadas – A, C, G, T – presentes na amostra, ou, em outras palavras, o sequenciamento de DNA é a determinação da ordem exata em que os nucleotídeos se encontram.

O primeiro método popular de sequenciamento de DNA foi o de terminação de cadeia, publicado em 1977 por Frederik Sanger, e tem sido largamente utilizado por centros de pesquisa ao redor do mundo até hoje. 

O método de sequenciamento de Sanger, é considerado uma tecnologia de “primeira geração”, e é útil e eficaz no sequenciamento de fragmentos de DNA de 500-900 pares de bases, sendo especificamente usado para sequenciar pequenas porções de DNA, como plasmídeos bacterianos ou fragmentos de DNA amplificados por PCR (reação em cadeia da polimerase ou polymerase chain reaction).

Em 1986 foi lançado o primeiro sequenciador automático de DNA, o ABI 370, e em 1998, o primeiro sequenciador de eletroforese capilar, o ABI 3700. 

Com a automatização foi possível realizar grandes projetos de sequenciamento, como o Projeto Genoma Humano completo, porém, ao custo de bilhões de dólares e de grandes centros com dezenas de máquinas instaladas. 

Apesar do sucesso no sequenciamento do genoma humano completo, o Sequenciamento de Sanger, é um método caro e ineficiente para projetos de larga escala. Para tarefas como essa, as novas técnicas de NGS são mais eficientes e possuem menor custo. 

E afinal, o que é Sequenciamento de Nova Geração ou NGS?

O Sequenciamento de Próxima ou Nova Geração (do inglês, Next-Generation Sequencing), também chamado de Sequenciamento Massivo em Paralelo (do inglês, Massive ou Massively Parallel Sequencing) ou Sequenciamento de Alta Performance (do inglês, High-throughput Sequencing) são diferentes termos que dizem respeito a um grupo de diferentes e modernas metodologias de sequenciamento do DNA (Figura 1). 

Figura 1 – Esquema dos processos envolvendo o sequenciamento de NGS

ngs-post_imagem_3

O NGS pode ser caracterizado como um sequenciamento automatizado, paralelo e de alto rendimento. 

A chegada das tecnologias de NGS no mercado mudou a forma como pensamos sobre abordagens científicas em pesquisa básica, aplicada e clínica e no diagnóstico genético, trazendo novas perspectivas para a medicina de precisão. Essas tecnologias permitem sequenciar o DNA de forma muito mais rápida e barata em comparação com o sequenciamento de Sanger, usado anteriormente, e revolucionaram o estudo da genômica e da biologia molecular.

Apesar de se diferenciarem consideravelmente entre si, todos os sequenciadores de NGS se baseiam no processamento paralelo massivo de fragmentos de DNA. Isto é, enquanto um sequenciador de eletroforese capilar processa, no máximo, 96 fragmentos por vez, os sequenciadores de nova geração podem ler até bilhões de fragmentos ao mesmo tempo

Com o NGS pode-se sequenciar o genoma inteiro ou apenas áreas específicas de interesse, incluindo todos os aproximadamente 20.000 genes codificadores (sequenciamento do exoma completo, do inglês, whole exome sequencing ou WES) ou um pequeno número de genes individuais (sequenciamento de genes alvo, do inglês, targeted sequencing). Em qualquer uma dessas opções, o NGS consegue detectar mutações na sequência do DNA que podem ser pequenas trocas (substituições), inserções e deleções de nucleotídeos. 

O resultado de um NGS é um arquivo contendo a posição exata de cada nucleotídeo do DNA, e a partir dele é possível analisar as mudanças nas sequências do DNA do indivíduo. 

Nesse contexto, existem diversas plataformas online que estimam o possível dano que uma alteração específica pode ocasionar na proteína que codifica

Cada plataforma faz essa predição através de métricas específicas e assim classificam se a variação tem mais chance de não ter causado nenhuma mudança na proteína (ou seja, é uma mutação benigna) ou ter causado uma mudança leve ou grave (mutação possivelmente patogênica ou patogênica). 

Ainda, o NGS é altamente eficiente no diagnóstico molecular de doenças genéticas e cânceres hereditários ou não hereditários causados por variantes germinativas, ou seja, alterações genéticas que foram herdadas e que portanto afetam todas as células de um indivíduo e variantes somáticas, isto é, mutações que ocorreram após o desenvolvimento, em algum momento da vida, e estão presentes em um ou mais tecidos específicos.

Quais são os tipos de NGS? 

Existem diferenças básicas entre o tipo de NGS que pode ser requerido para pesquisa ou diagnóstico clínico a depender do que se está buscando. Essas diferenças não estão necessariamente baseadas na plataforma utilizada para realizar o sequenciamento, por exemplo MiSeq Illumina ou Ion Torrent, mas sim nas sequências resultantes do sequenciamento. Portanto, é necessário saber o que se deseja buscar ao final do sequenciamento antes de solicitar o tipo de NGS

Nos subtópicos a seguir vamos explicar o que é cada tipo de NGS e para que cada um é indicado.

  • Sequenciamento do Genoma Completo, WGS

O sequenciamento do genoma completo (do inglês, Whole Genome Sequencing ou WGS) é como o nome já diz, o sequenciamento de todo o material genético ou DNA de um indivíduo. Esse sequenciamento irá incluir o DNA codificante e não codificante (Figura 2).

Figura 2 – Ilustração das diferentes partes que compõem o genoma 

ngs-post_Prancheta_1_cópia_copy

O WGS resulta em um arquivo muito grande com uma infinidade de informações sobre o material genético que podem ter uma interpretação clínica ou não. 

Alterações na porção codificante do DNA, aproximadamente 2% dele, são mais passíveis de interpretação clínica, enquanto que alterações nos aproximadamente 98% do DNA ainda não possuem informações sobre suas possíveis consequências ao indivíduo. 

Além disso, o WGS tem um custo maior tanto para seu processamento quanto para o armazenamento do resultado. 

Portanto, o WGS é mais indicado em estudos científicos visando estudar as consequências das alterações em regiões ainda não estudadas ou a busca pelas alterações que causam doenças ainda sem causa elucidada, por exemplo.

  • Sequenciamento do exoma completo, WES

O WES é o sequenciamento da porção codificante do DNA, ou seja, de todas as sequências de DNA que codificam os aproximadamente 19.000 genes do genoma humano. 

O termo exoma refere-se ao conjunto de éxons, que são as sequências do DNA que vão passar pelas etapas de transcrição e tradução até serem codificadas em proteínas.  

 Alterações nos genes causam alterações nas proteínas e consequentemente são mais prováveis de causarem doenças. Mutações no exoma são responsáveis pela grande maioria das doenças genéticas. 

Assim, o WES é um exame laboratorial eficiente e mais indicado para o diagnóstico clínico principalmente em casos em que existe hipótese diagnóstica de mais de uma doença específica, ou ainda, que não se tem hipótese diagnóstica específica.

O resultado de um WES é um arquivo com as mutações encontradas em todos os genes do indivíduo, o que exige um maior tempo de análise.

  • Sequenciamento de genes alvo, targeted sequencing ou painel de genes

O sequenciamento de genes alvo ou painel de genes é o NGS realizado de apenas um grupo de genes de interesse.  

Esse tipo de sequenciamento é semelhante ao WES, contudo, em vez sequenciar todos os genes do indivíduo, o sequenciamento é realizado em apenas um número de genes específicos: já associados a uma ou mais doenças, por exemplo. 

Portanto, quando se há uma hipótese diagnóstica de uma doença específica, o painel de genes é mais recomendado que o WES no diagnóstico clínico.

Atualmente os laboratórios que realizam NGS disponibilizam painéis de genes associados a diversas doenças genéticas, como câncer de mama e outros cânceres, doenças esqueléticas, musculares ou leucodistrofias, por exemplo. 

As vantagens do sequenciamento de painel de genes em relação ao WES são a economia no custo do NGS, visto que menos genes serão sequenciados, e diminuição no tempo de análise.

Footer blog vars-01

One thought on “O que é NGS (Next-Generation Sequencing)?

  1. A ciência em constante movimento. Tive a felicidade de participar como cientista no projeto genoma pelo laboratório de Biologia Molecular da USP.

Leave a Reply

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.